Clodronate Liposomes如何使用的相關(guān)問(wèn)題解答

    2018年蘇州螞蟻淘生物科技有限公司正式成為Clodronate liposomes的授權(quán)代理商，負(fù)責(zé)該公司巨噬細(xì)胞清除試劑在中國(guó)大陸的市場(chǎng)和銷(xiāo)售工作，此前使用的是陳舊的資料，今天螞蟻淘重新整理了一份Clodronate liposomes說(shuō)明書(shū)，以FAQS的形式展示如下：



1、是否有可能在體外使用氯膦酸脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞?

    是的，在體外消耗巨噬細(xì)胞是可能的，但請(qǐng)記住，這種方法特別適用于“體內(nèi)”研究。原因是Clodronate從死qu的巨噬細(xì)胞釋放或泄漏培養(yǎng)基中發(fā)布的脂質(zhì)體(依賴(lài)于介質(zhì)的組成)不能逃離媒介而Clodronate,一旦“體內(nèi)”發(fā)布,半衰期很短,由于其快速切除腎臟。游離氯膦酸鹽分子不容易進(jìn)入細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兒茈y通過(guò)細(xì)胞膜(以及脂質(zhì)體磷脂雙層膜)。然而，如果它們留在周?chē)呐囵B(yǎng)基中，它們可能會(huì)慢慢積累成細(xì)胞。

    參見(jiàn)參考文獻(xiàn)Claassen, I., Van Rooijen, N., and Claassen, E., 1990. A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogenous cell populations ‘in vitro’, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. J. Immunol. Meth.. vol. 134. pp. 153-161. (#32).

 

2、清除肺泡巨噬細(xì)胞如何給藥？

    脂質(zhì)體既可經(jīng)鼻給藥，也可經(jīng)氣管給藥。

    參見(jiàn)參考文獻(xiàn)：DeHaan, A., Groen, G., Prop, J., Van Rooijen, N., Wilschut, J. 1996. Mucosal immunoadjuvant activity of liposomes: Role of alveolar macrophages. Immunology, 89; 488-493)
The difference may be that all liposomes once admiNISTered intratracheally, arrive in the lung (alveoli), whereas liposomes admiNISTered intranasally (if admiNISTration is not well performed

 

3、動(dòng)物注射氯膦酸脂質(zhì)體后死亡的原因？

    A、動(dòng)物在注射過(guò)程中死亡

    這可能是由于注射了非均勻懸浮的脂質(zhì)體。

    為了得到均勻的懸浮體，在注射前應(yīng)搖動(dòng)或攪拌脂質(zhì)體的懸浮體。一段時(shí)間后脂質(zhì)體會(huì)沉淀。如果注射時(shí)間太長(zhǎng)，它們甚至可能沉淀在注射器中，如果更多的動(dòng)物使用相同的注射器注射，這也可能導(dǎo)致不同的劑量，因?yàn)閭€(gè)動(dòng)物將得到更多的(部分沉淀)脂質(zhì)體比后一個(gè)動(dòng)物。

    另一個(gè)原因可能是注射過(guò)快。如果從冰箱中取出脂質(zhì)體，它們至少應(yīng)該有時(shí)間達(dá)到室溫。

    B、動(dòng)物在注射幾天之后死亡

    這可能是由于微生物污染和/或在注射前不久或注射期間激活動(dòng)物造成的。請(qǐng)記住，巨噬細(xì)胞的缺失可能導(dǎo)致病毒滴度、細(xì)菌或酵母菌的增加。

 

4、脂質(zhì)體標(biāo)簽如何應(yīng)用？

    對(duì)照脂質(zhì)體可能被標(biāo)記，例如用熒光染料DiI，因?yàn)樗鼈儾挥绊懢奘杉?xì)胞。因此，該標(biāo)簽將顯示組織內(nèi)脂質(zhì)體的分布模式及其被巨噬細(xì)胞攝取。我們通常不發(fā)送帶有DiI標(biāo)記的氯膦酸脂質(zhì)體，原因如下:氯膦酸脂質(zhì)體會(huì)殺死巨噬細(xì)胞;因此，一旦巨噬細(xì)胞死亡，DiI標(biāo)簽將被重新輻射，而該標(biāo)簽不再代表脂質(zhì)體的實(shí)際分布。因此，脂質(zhì)體要么含有氯膦酸鹽來(lái)消耗巨噬細(xì)胞，要么含有DiI來(lái)顯示哪些巨噬細(xì)胞正在吞噬脂質(zhì)體(或者脂質(zhì)體是否能夠到達(dá)待研究的巨噬細(xì)胞)。組合可能導(dǎo)致誤解。

 

材料：

PBS:磷酸0012;0,8% NaCl, pH 7,4

 

DiI的解決方案:

將1ml乙醇100%添加到2,5 mg DiI(分子探針文章編號(hào)D-3911)在35千赫的水浴中超聲1分鐘(嵴應(yīng)溶解)

 

方法：

每毫升脂質(zhì)體懸浮液中加入10微升DiI溶液；

*搖動(dòng)脂質(zhì)體懸浮液；

室溫(黑暗)孵育10分鐘；

以20.000 xG離心脂質(zhì)體10分鐘；

移除上層清液；

加入無(wú)菌PBS，復(fù)蘇；

以20.000 xG離心脂質(zhì)體10分鐘；

將無(wú)菌PBS添加到原始卷中；

在4攝氏度的溫度下儲(chǔ)存標(biāo)記為黑色的脂質(zhì)體

 

5、

    A1。大鼠成熟巨噬細(xì)胞對(duì)ed1和ed2呈陽(yáng)性。然而，它們的前體沒(méi)有表現(xiàn)出吞噬作用(直接離開(kāi)骨髓后)或很少的吞噬作用(在它們擴(kuò)散到成熟巨噬細(xì)胞前不久)也是陽(yáng)性的。這些前驅(qū)體對(duì)e。2是負(fù)的。因此，ed2 +細(xì)胞會(huì)*耗盡，但ed1 +細(xì)胞只會(huì)部分耗盡。ED1+消耗的百分比取決于前體/成熟巨噬細(xì)胞的實(shí)際比例，由于新前體的補(bǔ)充，可能在以后的時(shí)間間隔內(nèi)發(fā)生改變。

 

6、失敗的表現(xiàn)？

    請(qǐng)注意，氯膦酸酯脂質(zhì)體和對(duì)照脂質(zhì)體都是大批量生產(chǎn)的。這些母批得到一個(gè)*的代碼，并檢查氯膦酸鹽的含量和可能的污染后的準(zhǔn)備。這些批次的樣品被送往世界各地的幾個(gè)(ca 30)不同的實(shí)驗(yàn)室。因此，如果我們收到一封電子郵件，報(bào)告與脂質(zhì)體缺乏活性或污染有關(guān)的問(wèn)題，我們將檢查是否有其他來(lái)自實(shí)驗(yàn)室的投訴，這些實(shí)驗(yàn)室確實(shí)收到了與發(fā)給您的樣品相同批次的樣品。如果沒(méi)有，我們當(dāng)然會(huì)盡快通知您未來(lái)的投訴將到達(dá)我們。

    它們失效的具體地理相關(guān)原因可能是運(yùn)輸或儲(chǔ)存期間的溫度造成的。脂質(zhì)體在運(yùn)輸或儲(chǔ)存過(guò)程中，任何時(shí)候都不應(yīng)冷凍或加熱至攝氏30度以上。

    此外，在選擇給藥途徑時(shí)，應(yīng)確保脂質(zhì)體能夠暢通無(wú)阻地接近即將耗盡的吞噬細(xì)胞(見(jiàn)參考資料一章)。請(qǐng)記住，脂質(zhì)體是顆粒，不會(huì)穿過(guò)正常毛細(xì)血管內(nèi)皮。

    此外，巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物也需要從組織中確定它們的消耗。非特異性標(biāo)記的使用可能影響結(jié)果的可靠性。

 

7、如何處理氯膦酸脂質(zhì)體和控制脂質(zhì)體？

    氯膦酸脂質(zhì)體和對(duì)照脂質(zhì)體的懸浮液應(yīng)按原樣使用，不應(yīng)稀釋或進(jìn)行任何其他處理。如果在到達(dá)后的幾天內(nèi)不使用，可以將其保存在攝氏4度。從未凍結(jié)脂質(zhì)體! !

    脂質(zhì)體(作為顆粒)容易沉淀。因此，在將懸浮液分成更小的體積或注射到動(dòng)物體內(nèi)之前，應(yīng)輕輕搖動(dòng)懸浮液，以便再次獲得均勻的懸浮液，并使脂質(zhì)體在整個(gè)懸浮液中均勻分布。如果儲(chǔ)存在4攝氏度，脂質(zhì)體應(yīng)該有機(jī)會(huì)達(dá)到室溫之前注射。永遠(yuǎn)不要注射冷脂質(zhì)體!

 

8、增加氯膦酸脂質(zhì)體的濃度

    A、

    不，氯膦酸鹽在脂質(zhì)體內(nèi)的水艙中的濃度受氯膦酸鹽溶解度的限制，在標(biāo)準(zhǔn)的氯膦酸鹽脂質(zhì)體懸浮液中保持大濃度。

    B、

    這是不推薦靜脈注射，因?yàn)榱鲃?dòng)性會(huì)降低，這可能導(dǎo)致堵塞毛細(xì)血管。然而，它也可以嘗試，例如在松散編織的組織中局部注射，或在脂質(zhì)體逐漸進(jìn)入循環(huán)之前從脂質(zhì)體被過(guò)濾的腹腔內(nèi)注射。

    C、如何確定用量？

    靜脈注射每10克體重不應(yīng)超過(guò)0.1毫升。然而，腹腔內(nèi)注射時(shí)，注射量可大大增加。對(duì)于皮下注射，大注射量取決于注射部位的儲(chǔ)存能力。

    D、

    Clodronate體內(nèi)的半衰期是以來(lái)的15分鐘,是很有區(qū)別的注射高劑量的免費(fèi)Clodronate,這將減少到一半的原始值每15分鐘,注射相同劑量的脂質(zhì)體將從死qu的巨噬細(xì)胞釋放緩慢。

    在種情況下，有一個(gè)高濃度，將迅速減少。在第二種情況下，濃度要低得多，但可以維持更長(zhǎng)的時(shí)間。

 

9、巨噬細(xì)胞的長(zhǎng)期消耗

    在正常情況下，即在沒(méi)有某些微生物產(chǎn)物激活的情況下，巨噬細(xì)胞群，如肝臟中的庫(kù)普弗細(xì)胞和脾臟中的紅髓巨噬細(xì)胞，在約1周后開(kāi)始重新填充它們的隔室。

    其他巨噬細(xì)胞群，如脾臟邊緣嗜金屬巨噬細(xì)胞和邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞(靜脈注射后)和淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞(引流區(qū)皮下注射后)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都不存在(見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)底稿)。

    為了實(shí)現(xiàn)SCID小鼠巨噬細(xì)胞的長(zhǎng)期耗竭，F(xiàn)raser等人(Blood, 86;嘗試了幾種注射方案，其中，一次未稀釋的氯丙酸脂質(zhì)體注射后，隨后每5-7天稀釋一次氯丙酸脂質(zhì)體。

    然而，我們應(yīng)該記住巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)各種非吞噬細(xì)胞的功能。因此，它們的長(zhǎng)期缺失可能終導(dǎo)致功能不活躍，甚至這些非吞噬細(xì)胞的消失。

 

10、巨噬細(xì)胞前體(單核細(xì)胞)

    而靜脈注射Clodronate脂質(zhì)體沒(méi)有成熟的巨噬細(xì)胞如腸道,由于脂質(zhì)體不能跨毛細(xì)血管的血管內(nèi)皮,Galeazzi et al . (Am J. Physiol. 278 G259-G265, 2000, 見(jiàn)還在手稿)描述的影響通過(guò)靜脈注射Clodronate脂質(zhì)體的炎癥誘導(dǎo)招聘和滲透F4/80陽(yáng)性細(xì)胞的小鼠空腸。關(guān)于這個(gè)問(wèn)題，以下幾點(diǎn)很重要:巨噬細(xì)胞(單核細(xì)胞)的前體被招募到例如炎癥區(qū)域，循環(huán)中的氯膦酸脂質(zhì)體似乎耗盡了。在這種情況下，幾次注射氯膦酸脂質(zhì)體后不久，必須給予對(duì)方，因?yàn)?。脂質(zhì)體在循環(huán)中存活時(shí)間不長(zhǎng)。相對(duì)于成熟的巨噬細(xì)胞，新的單核細(xì)胞可以在較短的時(shí)間內(nèi)被招募。在Galeazzi等人的研究中，給予氯膦酸酯脂質(zhì)體4小時(shí)。在感染前、感染后1、2、4天內(nèi)，應(yīng)保證盡可能多地消耗所招募的前體。-顯然，他們得到了大量的，在他們的情況下，也有足夠的損耗，但幾乎*的損耗從來(lái)沒(méi)有報(bào)告過(guò)。-在更多的研究中，氯膦酸脂質(zhì)體的作用只能通過(guò)假設(shè)在循環(huán)或單核/內(nèi)皮相互作用水平上對(duì)巨噬細(xì)胞前體的作用來(lái)解釋。關(guān)于血腦屏障(BBB)，后者的作用可能是通過(guò)將甘露糖殘基摻入含脂質(zhì)體的氯膦酸鹽中來(lái)介導(dǎo)的，Huitinga等(J. Exp. Med. 172; 1025-1033, 1990）描述了甘露醇酯類(lèi)氯膦酸脂質(zhì)體在實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)模型中的作用。——然而在Clodronate脂質(zhì)體的研究多次(每周2次)和靜脈注射給正常小鼠,成熟的巨噬細(xì)胞在各種器官血管障礙防止直接進(jìn)入成熟的巨噬細(xì)胞,并沒(méi)有耗盡即使在一個(gè)月之后,強(qiáng)調(diào)單核細(xì)胞維持正常營(yíng)業(yè)額招募巨噬細(xì)胞在這些器官,沒(méi)有受到明顯影響。

 

    請(qǐng)同時(shí)參閱新聞部分:

Blood monocytes (the precursors of mature resident macrophages) can be depleted by intravenous injection of Clodronate liposomes.
In: J. Immunol. 2004 Apr 1;172(7):4410-7.
Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response.
by: Sunderkotter C, Nikolic T, Dillon MJ, Van Rooijen N, Stehling M, Drevets DA, Leenen PJ.

 

11、生產(chǎn)及裝運(yùn)時(shí)間表？

    訂單在周一、周二和周四發(fā)貨。通過(guò)電子郵件發(fā)送的采購(gòu)訂單可能需要幾天的時(shí)間來(lái)處理。

    在此之后收到的訂單早將于下周發(fā)貨。盡管我們通常準(zhǔn)備的脂質(zhì)體懸浮液比滿足所有要求所需的多一點(diǎn)，但我們每周的生產(chǎn)計(jì)劃都是根據(jù)這些要求制定的。

    如果你想確定脂質(zhì)體的存在，當(dāng)你在進(jìn)行中的實(shí)驗(yàn)中需要這些時(shí)，你應(yīng)該至少提前兩周訂購(gòu)。更好的方法是在脂質(zhì)體已經(jīng)儲(chǔ)存在冰箱里的時(shí)候開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。雖然我們通常每周發(fā)貨，但疾病或其他不可預(yù)見(jiàn)的情況可能會(huì)打斷這個(gè)過(guò)程!

    如果您的訂單在 2周內(nèi)沒(méi)有到達(dá)，有兩個(gè)主要原因。

1. 該包裹被您的組織拒絕，因?yàn)槟拿植粸閮?nèi)部分發(fā)郵件的人所知，或者您的地址不完整。

2. 另一個(gè)人已經(jīng)接受了這個(gè)包裹，但沒(méi)有告訴你這件事。如果這種情況不止一次發(fā)生，你的賬戶就會(huì)被封，直到一切都解決了，因?yàn)樘嗟臅r(shí)間和材料都因?yàn)檫@些原因被破壞了。